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Dalvm 發表於 2019-5-4 11:42

基因治療走出寂靜

- 基因療法經過無數次挫敗後,科學家應用基因療法治療失聽終於有了進展。
Out of the Silence
作者╱馬隆 ( Dina Fine Maron )
譯者╱鄧子衿
柯德曼(Hannah Corderman)想填補她生活中的空白,可是空白卻逐漸擴大。她無法聽清楚別人說的話,得經由觀察交談的人,尋找適合點頭或微笑的時機。就算最近醫生把她的助聽器音量調大,她也越來越難聽到個別字詞。她說:「在跟別人說話時,很多字句的片段都聽不到了,但是我盡力去聽。」聽清楚別人說話變得越來越費力。柯德曼罹患的是遺傳疾病「尤塞氏綜合症」(Usher syndrome),這疾病會慢慢剝奪她的兩種主要感官︰視覺與聽覺。基因突變使內耳細胞和視網膜細胞中偵測聲音和光的蛋白質越來越少,柯德曼除了聽力流失,視力也越來越差。她10幾歲時便無法在夜間開車,這幾年情況更糟。現在她才24歲,由於視野中出現了一些盲點,連在白天也不容易看得清楚。目前沒有任何療法能夠治癒這種疾病,她很清楚自己在10年內便會失去聽覺與視覺,如果病情惡化得慢,可能是在20年內。

柯德曼童年時只有聽力出問題。中學某個夏天,她在美國麻州尼德罕的家中眺望夜空,星星似乎一顆顆消失了,她以為可能是被雲遮住了。不過狀況持續惡化,最後醫生診斷出她罹患尤塞氏綜合症2A型,並告訴她,接下來許多年,耳聾目盲的狀況會越來越明顯。我採訪她時,她說當時已平靜接受了這個噩耗。她說了解這個狀況後,決定還是要好好過日子。從確診到現在已經七年,柯德曼完成了大學學業,在自家經營的建設公司從事行銷工作。她說她不會受限於這個疾病,會盡力對抗。醫生能做的事情很少。柯德曼將來會植入人工電子耳(cochlear implant),這種儀器繞過毛細胞,直接刺激聽覺神經,讓她產生一些聽覺。但這儀器不夠靈敏,只是堪用而已。而視網膜晶片(retinal implant)能模擬感受光的視網膜細胞,但很少人使用,因為產生的視覺和真實視覺差太多了。

柯德曼不常看學術期刊,但是她知道在離家不遠的波士頓,有幾百隻年輕小鼠養在實驗室裡。科學家刻意培育出與她有相同聽覺問題的小鼠,而現在牠們的狀況好轉了。生物學家利用基因療法把正常DNA送到小鼠體內,取代製造缺陷蛋白質的DNA片段。2017年,波士頓兒童醫院的生物學家吉雷克(Gwenaëlle Géléoc)和同事報告,他們成功把DNA送到小鼠內耳,「前所未有的復原」讓小鼠的聽覺恢復到將近正常的水準。大約同時,哈佛醫學院另一個團隊也報告,他們用類似的遺傳技術,讓患有另一種遺傳疾病的小鼠恢復了部份聽覺。波士頓還有第三個團隊最近使用了基因剪輯技術,剔除了「貝多芬小鼠」的損壞基因,這種小鼠和德國古典作曲家貝多芬(Ludwig van Beethoven)一樣,有聽力逐漸喪失的症狀。遺傳性失聽是美國最常見的一種先天缺陷,這些進展帶來了一線希望,讓我們能夠治療這些疾病,甚至阻止源頭。


從病毒開始做起

基因療法的發展過程備極艱辛,經歷了高峰與低谷。1999年發生了一樁惡名昭彰的事件:18歲的肝病患者基爾辛格(Jesse Gelsinger)在基因療法的早期試驗中過世了。當時這項試驗由賓州大學的研究人員進行,他們利用病毒把基因送入基爾辛格體內,但病毒數量和種類刺激了基爾辛格的免疫系統,陷入瘋狂狀態的免疫系統攻擊體內器官。這個悲劇澆熄了大眾對於基因療法的熱情、遏止了資金來源,也讓許多科學家裹足不前。

但有些科學家繼續默默嘗試這項技術,最初在細胞和動物模式上測試,希望能夠發展出治療複雜疾病的方式,這些疾病包括骨關節炎(osteoarthritis)、癌症以及第一型糖尿病。為了安全起見,他們減少了攜帶基因的病毒數量,使免疫系統不致過度反應;他們也不再使用當年應用在基爾辛格身上的腺病毒(adenoviruse)。在這些試驗中,另一種病毒表現得特別好,是腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV),它能夠攜帶基因卻不會刺激人類免疫系統或傷害人體細胞。有時候,科學家也會先把這些病毒包裹在細胞中才進行注射。美國基因與細胞療法協會會長、國家衛生研究院(NIH)的研究員鄧巴(Cynthia E. Dunbar)說,現在這個領域的研究重點變成「找到匹配疾病與目標細胞的病毒,以及了解病毒劑量多寡和在身體中的分佈。」

這些改善工作終於有了回報。美國食品及藥物管理局(FDA)最近核准了一波人體基因療法,意味著基因療法的時代可能來臨了。2017年8月,FDA放行了CAR-T療法Kymriah,這種療法可以治療某一種兒童白血病,其中應用了病毒來運送基因。同年12月,FDA核可了第一種基因療法,這種療法可治療一種罕見的遺傳性失明。鄧巴說,現在許多藥廠和創投家把大量資金投入基因療法領域。美國基因與細胞療法協會2018年年會約有3400人參加,五年前只有1200人。

現在這股熱潮延伸到失聽領域,這種疾病通常是遺傳所致。雖然一般人認為失聽的原因是年老或意外事件,但失聽其實是美國最常發生的一種先天缺陷,美國每1000名新生兒約有三名患有聽力缺陷,其中一半以上是遺傳所致,包括尤塞氏綜合症這類疾病。尤塞氏綜合症受到矚目,原因在於患者只有一個基因發生了突變,修復了這個基因就等於治好了疾病。有些案例疾病惡化是漸進的,如同柯德曼,在確診後還有一段時間能阻止遺傳造成的傷害。柯德曼和其他尤塞氏綜合症患者的缺陷基因,會使內耳中傳遞外界聲波到腦部的毛細胞退化。哈佛醫學院的科學家科瑞(David Corey)說,這些毛細胞像是「耳朵的汽車火星塞,若缺損就無法產生聽覺。」

採用高科技的助聽器只是治標,基因療法才是根治疾病的方式。並未參與上述工作的加州大學聖地牙哥分校小兒科教授佛里特曼(Theodore Friedmann),是該校基因療法研究聯盟的主持人,他表示最近「基因療法有顯著的進展,應用於失聽領域的初步研究頗具希望。」小鼠當然不是人類,但佛里特曼說,失聽的基因療法研究首度開啟由遺傳方式治療失聽的大門。


治療聽覺毛細胞

2017年某個早晨,我在哈佛醫學院的一間實驗室中,看到科瑞的博士後研究員高吉(Bence György)彎著腰走出門外,手上拿著一些毛細胞有缺陷的小鼠。這些小鼠已經麻醉了,高吉在小鼠耳後切一道細小的傷口,推開像紙那麼薄的組織,露出中耳通往內耳的門戶圓窗膜(round window membrane)。高吉把細細的針頭插入圓窗膜,慢慢注入粉紅色液體,液體中約有2000億顆AAV顆粒,每顆都攜帶了導致小鼠失聽的致病基因的修正版本。利用AAV運送寶貴藥物,提高了基因進入內耳目標細胞的機率,這些經遺傳工程改造、已去除毒性的病毒依然擅長感染細胞。

研究人員已知不能任意採用AAV。許多種AAV都能把DNA運送至內毛細胞,這些毛細胞負責把訊息傳遞到神經元。但是這些病毒難以感染外毛細胞,聲波一開始要靠這些毛細胞放大。科瑞對於毛細胞的功能進行了一些重要研究,他說為了讓聽力完全恢復,載送基因的病毒必須能夠感染內耳中的內毛與外毛兩種毛細胞。

科學家經過一連串嘗試錯誤,重新設計了病毒的某些基因,得到能夠同時感染兩種內耳毛細胞的AAV。科學家改造了構成病毒外殼的蛋白質,能幫助病毒和細胞上的目標物結合。最後他們製造出一組外殼蛋白質,能夠和兩種毛細胞表面的分子結合,讓病毒進入細胞。2017年吉雷克和同事發表了一篇論文,指出有一種改造後的AAV能夠完整進入罹患遺傳性失聽的基改小鼠耳中,並且讓數排毛細胞的功能恢復正常。其他研究團隊也報告,他們讓類似的AAV進入年老小鼠的內耳細胞中,這些內耳細胞和人類孩童的內耳細胞類似。

讓病毒進入細胞只是聽力治療的一部份,另一部份是確認導致失聽的基因突變。1990年代研究人員開始找出患有典型尤塞氏綜合症、失明與失聽症狀的家庭,比較各個家庭成員的基因組。科學家最先懷疑這些成員攜帶數個可能參與耳朵和眼睛發育的突變基因,並培育具備和沒有嫌疑突變基因的小鼠,看看哪些突變造成了症狀。透過這樣的比較,科學家發現了一些特別的基因變化,例如USH2A這個基因突變,造成了發生在柯德曼身上這種漸進性症狀;而USH2A沒有突變的毛細胞,功能是正常的。


恢復聽力的小鼠

惡化最嚴重也最快速的尤塞氏綜合症患者,是因為五個基因的一個發生了突變,USH1C是其中之一。過去幾年,吉雷克與丈夫耳鼻喉科醫生霍爾特(Jeffrey Holt)以及同事,去除了具有特製外殼的AAV中與病毒複製相關的基因,以完整健康的USH1C替換。他們也加上了能夠讓USH1C在毛細胞中開啟的啟動子(promoter)DNA序列。這個新基因送進細胞就像是大補丸,細胞中原有的缺陷基因依然會製造功能不足的蛋白質,但新加入的健康基因會讓細胞製造大量的健康蛋白質,讓毛細胞維持健壯。
波士頓兒童醫院的團隊也把整顆病毒送進罹患尤塞氏綜合症的小鼠耳中,方法和高吉使用的類似。兩星期後,病毒感染了一些細胞,過了六星期,病毒進入了大約八成的細胞。更重要的是,這些小鼠對聲音有反應了。測試牠們的聽力是否恢復,主要方式是突然發出一聲響亮的噪音,看小鼠會不會跳起來。這些小鼠很多都會,耳聾的小鼠現在聽得見了。

重要的不光是聽覺。毛細胞還有另一種極為重要的功能:毛細胞在內耳的體液中彎曲擺動時,會發出訊息給腦部,告知自身位置,腦部藉由此訊號產生身體平衡感與方向感。罹患尤塞氏綜合症的小鼠,行動時往往有困難,難以認清自己在環境中的位置。這些小鼠不會在籠中到處嗅來嗅去,而是蜷縮在角落。正常小鼠天生就會游泳,第一次下水就能掙扎游動,但尤塞氏綜合症小鼠下水後會翻轉滑動,奮力想找出「上方」。波士頓兒童醫院接受基因療法的小鼠,在毛細胞的功能完全恢復後,就不會出現這種問題。

我在哈佛醫學院吉雷克的實驗室中和霍爾特碰面。我發現這些接受基因療法的小鼠,其動作反應,嗯,就和正常小鼠一樣:接受基因療法的小鼠,兩個月後會到處嗅來嗅去,在開放空間和水中的表現就和正常小鼠沒兩樣,牠們行動得如此自在,讓我再三和霍爾特與其他同事確認,牠們是否真的是罹患尤塞氏綜合症的小鼠。霍爾特有詳細記錄實驗動物的實驗記錄系統,再三和我保證我看到的小鼠,確實是聽力受損但後來接受治療的小鼠。


基因大小是阻礙

動物實驗雖然成功了,但是還有一些艱鉅的障礙要突破,才能夠在人體使用這種病毒。其中之一是目前使用的AAV太小了,雖然這些AAV足以攜帶取代尤塞氏綜合症1C型的正確基因(在小鼠試驗中對這種基因的療效很好),但是造成尤塞氏綜合症其他亞型的致病基因很大,例如引發柯德曼症狀的基因就大到無法塞進AAV的儲藏空間中。鄧巴說:「就好像讓14號身材的人穿4號褲子。」

解決這個問題的其中一種方法是把大基因切成數份,分別裝在不同的病毒載體中,每段DNA的兩端都是不平齊的。這些DNA片段抵達目的地後,會如魔鬼氈那樣彼此連接。柯德曼的尤塞氏綜合症致病基因很大,需切成三段,各自攜帶一段DNA的三種病毒都要進入內耳毛細胞中,讓這三段DNA在細胞裡重新連接。吉雷克說,DNA本身的特質讓這件事情能成功:在體內,只有互補的遺傳序列才能夠發生交互作用。不過這個障礙還未成功排除。

其他辦法是使用比較大的非AAV病毒,並改造這類病毒以免引起大規模免疫反應;另一個辦法是根本不使用病毒,而是利用奈米顆粒運送遺傳密碼(由實驗室製造出來的奈米顆粒能穿透細胞)。包括霍爾特與吉雷克在內的研究人員,正利用CRISPR/Cas9這種基因剪輯技術剪除造成問題的基因,以健康的基因取而代之。尤塞氏綜合症是隱性疾病,要一對基因同時有所缺陷才會發病。研究人員如果能剪除一個缺陷基因,換上一個正常的顯性基因,這個新基因便能夠彌補缺陷基因造成的負面效應。

但目前還沒有科學家以CRISPR達成這個目標,因為這個方式比較適合剪下DNA,而不是插入DNA。因此目前能以CRISPR治療的小鼠聽力問題,是由一個缺陷基因所致,而非一對。造成問題的基因可直接剪除,讓另一個正常基因好好發揮。雖然在貝多芬小鼠上進行這種試驗的成效良好,但是其他科學家利用CRISPR時,卻發現CRISPR在非目標細胞中造成了意外的DNA變異。因此,沒有人認為基因剪輯能應用在人體。目前來看,利用病毒當載體還是最有希望的方式。

不論研究人員設計了怎樣的基因傳遞系統或是其他解決方式,治療遺傳性失聽的先決條件是能夠在嬰兒時期就檢查出聽力流失的症狀,早期介入才能讓更多患者得到幫助。在美國,幾乎所有新生兒都接受了聽力篩檢,但很少能夠診斷出罹患了某種特殊疾病或有潛藏的遺傳病因。柯德曼的例子便是如此,她的遺傳症狀到了高中才診斷出來,這點需要改變,我們才能對兒童提供早期治療。

研究基因療法的科學家相信他們能夠治療兒童,而且可能不久就能實現。貝勒醫學院的基因療法研究員歐姆斯泰德—戴維斯(Elizabeth Olmsted-Davis)指出,她並不驚訝有些治療其他疾病的基因療法已經落實了,其他新療法最後也將走上相同道路。她說:「這些即將出現的療法,是數十年來許多傑出研究人員的成就累積,他們看到了這種療法的潛力。」

雖然在科學社群中,對於基因療法的興趣有如掀起的浪潮,但是柯德曼並沒有打算等到這波浪潮來臨。她決定不論是否有新療法,都要過充實的生活。她已經安排了看北極光的旅行,因為有天自己可能再也看不到北極光了。她說:「我常說我的生活已完全改變了,因為我能擁有聽力與視力的時間只有這麼多,而要做的事那麼多。」她也成為尤塞氏綜合症代言人,她了解公開表達對於這種遺傳疾病的看法有助於推動研究,並且「有可能激勵其他病患好好過生活,不要被這個疾病擊垮」。她說,失去聽力,並不意味要退縮在寂靜中。


End
重點提要
■失聽是最常見的一種先天缺陷,大部份是基因缺陷所致。基因療法這種有著曲折歷史的實驗性療法,將是重要的治療之道。
■最近基因療法的安全性和有效性提升了,也獲得美國食品及藥物管理局(FDA)的准許應用於治療幾種人類疾病,現在科學家正把基因療法應用領域擴展到失聽。
■科學家把攜帶基因的病毒注射到小鼠體內,失聽小鼠慢慢聽得到了,這項結果為失聽者帶來希望。

治療原理

送進聽力基因
幼兒失聽常見的原因之一是遺傳缺陷。內耳中的毛細胞負責偵測聲音,並把訊息傳遞到腦部,但是這些毛細胞中的基因突變讓毛細胞的結構受損。研究人員以小鼠為實驗動物,設計以正常基因取代缺陷基因的方式:他們把正常基因放入改造過的腺相關病毒(AAV)中,再把這些病毒注入內耳。這些病毒會感染內耳細胞,把正常基因送到細胞中。這種方式(下圖)如果在人體能試驗成功,將能解決大部份先天性失聽的遺傳病因。

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